REVISION

Actividad larvicida de extractos hidroalcohólicos de Pala scholaris (L.) Roberty sobre larvas de estadio III de Aedes aegypti

Larvicidal activity of hydroalcoholic extracts of Pala scholaris (L.) Roberty against III stage larvae of Aedes aegypti

Oscar Ivan Camacho-Romero¹, Stefanny Barrios-Márquez¹, Eduardo Lozano-Contreras², Leonardo García-Viloria²

¹ Gerencia de Investigación, Desarrollo e Innovación (I+D+i), Perseus Allianz S.A.S. Barranquilla, Colombia

² Facultad de Química y Farmacia, Universidad del Atlántico -Ciudadela Universitaria. Barranquilla, Colombia

* Autor para correspondencia.

Correo electrónico: oscarivancamacho@gmail.com (Oscar Ivan Camacho-Romero).

Recibido el 19 de abril de 2019; aceptado el 29 de julio de 2019.

Como citar este artículo:

Camacho-Romero OI, Barrios-Márquez S, Lozano-Contreras E, García-Viloria L. Actividad larvicida de extractos hidroalcohólicos de Pala scholaris (L.) Roberty sobre larvas de estadio III de Aedes aegypti. JONNPR. 2019;4(10):1022-31. DOI: 10.19230/jonnpr.3081

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Camacho-Romero OI, Barrios-Márquez S, Lozano-Contreras E, García-Viloria L. Larvicidal activity of hydroalcoholic extracts of Pala scholaris (L.) Roberty against III stage larvae of Aedes aegypti. JONNPR. 2019;4(10):1022-31. DOI: 10.19230/jonnpr.3081

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Resumen

Introducción. Mediante estudios etnobotánicos se ha demostrado que diversas plantas presentan propiedades utilizadas en la comunidad, orientadas hacia el manejo de los vectores transmisores de enfermedades.

Objetivo. Evaluar la actividad larvicida de extractos hidroalcohólicos de la corteza de Pala scholaris (L.) Roberty sobre larvas de estadio IV de Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).

Métodos. Se utilizaron larvas de Aedes aegypti en estadio III. La corteza de la especie fue recolectada en Puerto Colombia (Atlántico-Colombia), del cual se elaboraron los extractos hidroalcohólicos por maceración, y se realizaron ensayos de calidad, marcha fitoquímica preliminar y actividad biológica siguiendo las recomendaciones dadas por la Organización Mundial de la Salud.

Resultados. Los extractos hidroalcohólicos de Pala scholaris mostraron la presencia de fenoles, saponinas, terpenos y flavonoides en gran medida, mientras que la actividad larvicida mostrada fue moderada con una CL₅₀ de 475,42 ppm y 403,55 ppm, de los extractos elaborados con relación etanol/agua 1:1 y 7:3, respectivamente.

Conclusiones. Se consideró que el extracto de corteza de Pala scholaris podría ser una especie prometedora para la obtención de metabolitos secundarios con actividad larvicida.

Palabras clave

dengue; larvicida; hojas; extractos; Stegomyia aegypti; marcha fitoquímica

Abstract

Introduction. Through ethnobotanical studies, it has been shown that several plants have properties used in the community, oriented towards the management of disease-transmitting vectors.

Objective. To evaluate the larvicidal activity of hydroalcoholic extracts of the bark of Pala scholaris (L.) Roberty on stage IV larvae of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).

Method. Aedes aegypti larvae were used in stage III. The bark of the species was collected in Puerto Colombia (Atlántico-Colombia), from which the hydroalcoholic extracts were elaborated by maceration, and quality tests, preliminary phytochemical march and biological activity were carried out following the recommendations given by the World Health Organization.

Results. The hydroalcoholic extracts of Pala scholaris showed the presence of phenols, saponins, terpenes and flavonoids to a large extent, while the larvicidal activity shown was moderate with an LC₅₀ of 475,42 ppm and 403,55 ppm, of the extracts elaborated with ethanol/water relation 1:1 and 7:3, respectively.

Conclusions. It was considered that the bark extract of Pala scholaris could be a promising species for obtaining secondary metabolites with larvicidal activity.

Keywords

dengue; larvicidal; leaves; extracts; Stegomyia aegypti; phytochemical screening

Introducción

El dengue es una enfermedad de interés en salud pública, por el impacto que ocasiona en morbilidad y mortalidad a nivel mundial, nacional y local ⁽¹⁾, en las últimas décadas el índice de casos de esta endemia ha aumentado, donde más de 2.500 millones de personas aproximadamente el 40% de la población mundial están en riesgo de contraer esta enfermedad; de acuerdo a cifras de la Organización Mundial de la Salud (OMS) ^(2-3), calcula que cada año se producen entre 50 y 100 millones de infecciones por el virus proveniente del Aedes aegypti en el mundo ⁽⁴⁾. Esta situación se agrava en países donde predomina el clima tropical y subtropical, con condiciones de temperatura, humedad relativa y altitud óptima para el desarrollo del mosquito responsable de la transmisión de uno de los 4 cuatro serotipos identificados (DEN-1, DEN-2, DEN-3 y DEN-4)^(5-6).

Colombia es el segundo país en Suramérica después de Brasil con mayor incidencia de esta enfermedad; en las últimas décadas en el territorio nacional se observa un comportamiento de carácter creciente⁽¹⁾. A pesar de existir en el mercado insecticidas químicos neurotóxicos (organoclorados, organofosforados, carbamatos, piretroides, entre otros) ⁽⁷⁾. Para frenar el crecimiento de las poblaciones de Aedes aegypti, sin embargo el constante uso de estas sustancias ha generado resistencia en las poblaciones de este vector ⁽⁸⁾.

A nivel mundial se plantea la búsqueda de plantas que posean constituyentes con propiedades que inhiban el estado larvario de Aedes aegypti ⁽⁹⁾, con el fin de poner freno al constante desarrollo del vector responsable de diversas enfermedades que día tras día causa miles de muertes. Es por ello, que especies pertenecientes a la familia Apocynaceae presentan constituyentes activos que son reconocidos como insecticidas ⁽¹⁰⁾.

Por lo anterior, se planteó evaluar la actividad larvicida de extractos hidroalcohólicos de la corteza de Pala scholaris (L.) Roberty sobre larvas de estadio IV de Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).

Métodos

Se planteó un estudio de tipo descriptivo-transversal ⁽¹¹⁾, y se ejecutó en las instalaciones del laboratorio de Investigaciones adscrito a la Facultad de Química y Farmacia de la Universidad del Atlántico, durante el periodo de marzo-agosto del 2014.

Recolección del material vegetal

La recolección de la corteza de Pala scholaris (L.) Roberty, también conocida como Alstonia scholaris (L.) R.Br., se realizó en el municipio de Puerto Colombia, Departamento del Atlántico, de la Costa Norte Colombiana, en marzo de 2014 (25°C, H.R. 70% y tiempo seco), sin presencia de partes dañadas o deterioradas por insectos, aproximadamente 650 g del órgano vegetal. A un espécimen completo de la planta se le realizó la identificación taxonómica en el Herbario Nacional Colombiano del Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá y registró con el código COL 576296.

Obtención de los extractos hidroalcohólicos

El material vegetal fue expuesto a secado a temperatura ambiente entre 29 ± 1°C, bajo sombra por 15 días. Posteriormente, fue llevado a un tamaño de partícula moderadamente grueso por molienda y sometido a extracción con dos mezclas en relación etanol/agua 1:1 y 7:3 por maceración por 8 días. Concluido el tiempo, se filtraron y concentraron en un rotaevaporador a 40°C y 80 rpm, obteniendo dos extractos hidroalcohólicos obtenidos bajo las mismas condiciones de extracción. Los extractos se almacenaron a 20 °C y protegidos de la luz durante el periodo de estudio ⁽¹²⁾.

Pruebas de calidad y Marcha fitoquímica preliminar

Para los controles de calidad se evaluó las características organolépticas (olor y color), densidad, pH, sólidos totales y rendimiento, según las metodologías descritas por Ochoa (2013) ⁽¹³⁾. Mientras, para determinar la presencia de los grupos químicos mayoritarios de los extractos hidroaocohólicos de la corteza de Pala scholaris, se utilizó diversas pruebas y reactivos específicos para identificar la presencia de flavonoides, alcaloides, taninos, antraquinonas, fenoles, glicósidos cardiotónicos, saponinas, leucoantocianinas, esteroles y terpenos ⁽¹⁴⁾.

Evaluación de la actividad larvicida

Las larvas de Aedes aegypti cepa Rockefeller se colectaron en la zona residencial del municipio de Barranquilla (Atlántico), a partir de reservas de agua potable, las cuales se trasladaron al Laboratorio de Salud Pública del Atlántico, donde se realizó su identificación y se obtuvieron huevos de la siguiente generación del vector. Posteriormente, se trasladaron al laboratorio para la formación del estado larvario de Aedes aegypti sumergidos en agua para inducir la eclosión, las larvas que emergieron se transfirieron a agua limpia para la alimentación de las mismas, se criaron hasta el III estadio ⁽¹⁵⁾, se seleccionaron las larvas necesarias para efectuar el ensayo biológico, bajo condiciones adecuadas de 29 ± 1°C y humedad relativa (72 ± 4%).

A partir del extracto seco, se realizaron concentraciones sucesivas de 1000, 500, 250, 150 y 100 ppm; se colocaron 20 larvas Aedes aegypti en envases de 100 mL de cada concentración según lo establecido por el protocolo de la OMS ⁽¹⁶⁾. Cada ensayo se realizó por triplicado. Como control positivo se usó temefos (fosforotionato de o,o,o,o'-tetrametil-o,o'-tio-di-p-fenileno)a 0,05 mg/L y como control negativo se empleó agua destilada ⁽¹⁷⁾. Las lecturas de mortalidad larvaria, se realizaron a las 1, 3, 6, 12, 24 y 36 h de exposición. Para el registro de las larvas que se declaraban muertas, se tenía en cuenta aquellas que no presentaban movimiento al contacto físico en el mesotórax ⁽¹⁵⁾.

Análisis estadístico

Se registraron y procesaron los datos cuantitativos del control de calidad expresados en promedio ± desviación estándar, mientras en el caso de la acción larvicida se procesó la mortalidad para calcular el porcentajes de mortalidad presentado por las concentraciones evaluadas; adicional, utilizando un análisis Probit del paquete estadístico Statgraphics Centurion XVI, se calculó los valores para CL₅₀ con sus respectivos límites de confianza al 95% ⁽¹⁸⁾.

Para el cálculo de los porcentajes de mortalidad se utilizaron las fórmulas que aparecen a continuación:

Resultados

Marcha fitoquímica preliminar

Tabla 1. Relación de metabolitos secundarios identificados en los extractos hidroalcohólicos de corteza de Pala scholaris.

Clase de metabolito secundario	Prueba y/o reactivo	Extracto hidroalcohólico de corteza
Clase de metabolito secundario	Prueba y/o reactivo	Relación 1:1	Relación 7:3
Alcaloides	Mayer	-	+
	Dragendorff	+	+
	Marquis	+++	++
	Hager	+	++
Fenoles	FeCl₃	++	+++
Flavonoides	Shinoda	++	++
Flavonoides	HCl	+	++
Leucoantocianinas	Rösenhein	++	+
Saponinas	Espuma	++	+++
Esteroles y terpenos	Placa con éter de petróleo: acetato de etilo (8:2) con revelador Liebermann Burchard	++	+++
Taninos	Gelatina-Sal	+	+
Antraquinonas	Bortränger-Krauss	-	-
Glicósidos cardiotónicos	Keller - Killiani	-	-

( – ): no identificado, ( + ): escaso, ( ++ ): moderado, ( +++ ): abundante.

De acuerdo con los resultados de la identificación de constituyentes mayoritarios, se evidenció la presencia de alcaloides, lo cual es soportado por las investigaciones de Salim (2004), donde informan el aislamiento e identificación de cinco alcaloides a partir de un extracto etanólico de corteza de P. Scholaris ⁽¹⁹⁾, esto coincide con las afirmaciones de Khyade (2014), donde se indica que estos metabolitos son los principales componentes de esta especie y han sido reportados en todos los órganos de la planta, siendo las hojas donde se encuentran con mayor abundancia ⁽²⁰⁾; también se identificaron fenoles, flavonoides, leucoantocianinas, saponinas, triterpenos en ambos extractos, la presencia estos constituyentes coincide con lo reportado por Khyade (2006) y Khyade-Vaikos (2010), en sus investigaciones en hojas y corteza de P. scholaris ^(21-22).

Tabla 2. Resultados promedios de los controles de calidad de los extractos

Control de calidad evaluado	Extracto hidroalcohólico de corteza (Etanol:H₂O)*
Control de calidad evaluado	Relación 1:1	Relación 7:3
Características organolépticas	Homogeneidad en textura Color: Marrón claro Olor: Madera-resina	Homogeneidad en textura Color: Marrón oscuro Olor: Madera-resina
Densidad (g/mL)	0,9834 ± 0,0001	0,9595 ± 0,0001
pH	6,02 ± 0,006	6,16 ± 0,015
Sólidos totales (g/mL)	0,0084 ± 0,0009	0,0062 ± 0,0011
Rendimiento (%)	2,92	2,81

* Valores por triplicado

Los ensayos de control de calidad de los extractos hidroalcohólicos permitieron diferenciar los extractos, teniendo en cuenta las características evaluadas, ambos extractos fueron homogéneos, presentaron un olor característico a madera-resina, color marrón, pero la intensidad del color fue diferente, debido a que el extracto hidroalcohólico de proporción 7:3, presentó una tonalidad oscura, esto se debe a que contiene una menor proporción de agua, que el extracto con proporción 1:1; estos resultados permiten establecer criterios de identificación de los extractos elaborados, teniendo en cuenta las diferencias encontradas; en relación con la densidad, el extracto con proporción 1:1 presentó un valor más alto, soportado por el aumento de la constante dieléctrica, lo cual permitió un mayor arrastre de sustancias ⁽²³⁾, este parámetro proporciona información acerca de la composición de los extractos evaluados, indicando que el extracto que presentó una mayor densidad, contiene mayor proporción de constituyentes polares y el extracto de proporción 7:3 contiene mayoritariamente sustancias menos polares, lo cual coincide con los resultados obtenidos en la marcha fitoquímica, donde este extracto presentó mayor cantidad de terpenos; esto se encuentra directamente relacionado con la cantidad de sólidos totales, que indican la cantidad de sustancias suspendidas en el extracto, este parámetro es muy variable porque depende muchos factores ⁽²⁴⁾, el extracto hidroalcohólico de proporción 1:1 presentó una mayor concentración de sustancias, en relación con el extracto hidroalcohólico de proporción 7:3.

Tabla 3. Porcentaje de mortalidad de los extractos hidroalcohólicos de corteza de Pala scholaris.

Extracto corteza	Concentración	Tiempo de contacto/ porcentaje de mortalidad (%)*
Extracto corteza	Concentración	1	3	6	12	24	36
Hidroalcohólico Etanol:H₂O (1:1)	100 ppm	0%	0%	0%	0%	0%	0%
	150 ppm	0%	0%	0%	0%	0%	3%
	250 ppm	0%	0%	0%	0%	5%	10%
	500 ppm	8%	18%	22%	25%	30%	37%
	1000 ppm	30%	73%	98%	100%	100%	100%
Hidroalcohólico Etanol:H₂O (7:3)	100 ppm	0%	0%	2%	2%	2%	2%
	150 ppm	0%	10%	10%	10%	12%	12%
	250 ppm	3%	13%	20%	22%	23%	25%
	500 ppm	5%	15%	32%	40%	55%	60%
	1000 ppm	20%	65%	83%	85%	90%	98%
Control positivo: Temefos (0,05 mg/L)		36%	72%	90%	100%	100%	100%
Control negativo: agua destilada		0%	0%	0%	0%	0%	0%

* Valores por triplicado

Al analizar los resultados del porcentaje de mortalidad de los extractos hidroalcohólicos a diferentes concentraciones con el factor tiempo de contacto, se pudo establecer ambos extractos presentan comportamientos similares, el extracto hidroalcohólico de proporción 1:1 presentó un porcentaje de mortalidad de 100% a partir de las 12 horas a concentración de 1000 ppm; por otra parte, el extracto hidroalcohólico de proporción 7:3 a concentración de 500 ppm presentó un porcentaje de mortalidad a las 36 horas de exposición del 60% de las larvas y a concentración de 1000 ppm, a partir de las 12 horas un porcentaje de mortalidad de 100%, por lo que este resultado resulta muy prometedor, teniendo en cuenta los resultados obtenidos para el control positivo, el insecticida larvario temefos, donde se observa un comportamiento muy parecido al de los extractos, con un porcentaje de mortalidad a las 12 horas de 100%, estos resultados se encuentran acorde a uno de los propósitos planteados por la Organización Mundial de la Salud, donde se promueve la investigación para el control vectorial, debido al fenómeno de resistencia hacia los insecticidas sintéticos^(25-26)^.

Tabla 4. Concentraciones letales 50 de los extractos hidroalcohólicos de corteza de Pala scholaris a 24 h de evaluación

Extracto corteza	Concentración	CL₅₀ (mg/L)	Límites de confianza (95%)
Extracto corteza	Concentración	CL₅₀ (mg/L)	Inferior	Superior
Hidroalcohólico Etanol:H₂O (1:1)	1000 ppm	475,42	447,71	503,14
Hidroalcohólico Etanol:H₂O (7:3)	1000 ppm	403,55	371,89	435,20

El extracto hidroalcohólico de corteza P. Scholaris a una concentración de 1000 ppm, con una proporción 1:1 obtuvo una CL₅₀ (mg/L) de 475,42 y el extracto de corteza P. Scholaris a una concentración de 1000 ppm, con una proporción 7:3 una CL₅₀ (mg/L) de 403,55, en la literatura se ha reportado que la actividad larvicida se debe principalmente a la presencia de monoterpenos, los cuales han demostrado actividad larvicida en diferentes especies de mosquitos; esto coincide con la presencia de estos constituyentes en los extractos evaluados, se ha descrito que la acción de los compuestos larvicidas se debe principalmente a la absorción por al tracto respiratorio o la ingestión de estos compuestos que al entrar en contacto con la larva causan un efecto generalizado, ocasionando la muerte⁽²⁷⁾, este efecto depende de la concentración y el tiempo de exposición, como se observó en los resultados obtenidos.

Conclusiones

Los extractos hidroalcohólicos totales de P. scholaris evaluados poseen una gran variedad de metabolitos secundarios tales como: alcaloides, fenoles, flavonoides, leucoantocianinas, saponinas y triterpenos; además presentaron unos valores de CL₅₀ de 475,42 y 403,55 mg/L, respectivamente; Por lo cual, se puede concluir, que esta especie es prometedora para ser usada como una alternativa natural para el control vectorial, con ventajas para el medio ambiente, teniendo en cuenta la toxicidad de los insecticidas utilizados comúnmente, se sugiere realizar estudios de elucidación estructural que permitan identificar los metabolitos secundarios presentes en los extractos totales responsables de la actividad larvicida, para facilitar utilización de los mismos en una formulación y así evitar el inconveniente de los extractos totales de incorporarse en el agua, debido a que alteran sus propiedades organolépticas.

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